ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫЕ БАКТЕРИОФАГИ: ОБЗОР ДОСТИЖЕНИЙ ПОСЛЕДНЕГО ДЕСЯТИЛЕТИЯhttp://old.medach.pro/wp-content/uploads/2017/12/fagi-oblozhka-724x1024.jpg
Ссылка

http://old.medach.pro/wp-content/uploads/2017/12/fag6-1024x555.pnghttp://s19.rimg.info/e2fe88c3f56bc30b798d68ac3757bdcd.gif
Бактериофаги были открыты в начале XX века. Вскоре после открытия обнаружился большой потенциал их применения в качестве противомикробных препаратов, который до сих пор не осознается в полной мере. Зарождающаяся область фаговой терапии была скомпрометирована неправильно контролируемыми исследованиями, а после открытия антибиотиков и вовсе отодвинута на второй план. Несмотря на замедление разработок противомикробных препаратов на основе бактериофагов, последние сыграли важную роль в развитии молекулярной биологии. Наблюдаемый в последние годы рост числа мультирезистентных штаммов бактерий способствовал возрождению интереса к противомикробному действию фагов. Благодаря широкому диапазону возможностей генной инженерии эти бактериальные вирусы могут быть модифицированы с целью достижения точного контроля и обнаружения бактерий и, таким образом, послужить новым источником антимикробных средств. Кроме применения в антимикробной терапии, фаги также могут быть использованы как транспортные системы для доставки препаратов, как вакцины или же могут быть использованы для сборки новых материалов. В данном обзоре рассматриваются последние достижения в технологиях создания фагов для всех вышеупомянутых целей, обсуждаются имеющиеся сложности и возможности дальнейших разработок.

Бактериофаги (фаги) являются одними из наиболее распространенных биологических частиц на Земле. Они обладают высокой изменчивостью и могут быть адаптированы для широкого диапазона применений. Фаги представляют из себя вирусы, заражающие бактерии; их самовоспроизведение зависит от наличия бактерии-хозяина. Фаги были открыты Фредериком Твортом в 1915 [1] и, независимо от него, Феликсом Д’Эреллем в 1917 [2], и поначалу действительно использовались в качестве противомикробных средств. Несмотря на многообещающие результаты первых испытаний фаговой терапии [3,4], плохой контроль исследований и противоречащие результаты породили в научном сообществе разногласия относительно эффективности и воспроизводимости результатов фаговой терапии в отношении бактериальных инфекций [5‒7]. Открытие пенициллина в 1928 году и последующее наступление эры антибиотиков еще сильней пошатнуло позиции фагов как противомикробных средств [5,6]. В результате в странах Запада изучение фаговой терапии было приостановлено, хотя их применение продолжалось в Восточной Европе и Советском Союзе [8‒10]. Несмотря на значительный успех антибиотиков в улучшении здоровья человечества, все чаще выявляются случаи антибиотикорезистентности, что делает многие антибиотики неэффективными [11‒14]. На данный момент мультирезистентные бактерии представляют собой одну из наиболее распространенных угроз для глобального здоровья [15‒17]. Каждый год только в США более 2 млн человек инфицируются антибиотикорезистентными бактериями, что приводит как минимум к 23000 смертей ежегодно [16]. Нарастающая волна антибиотикорезистентности совместно с низкой скоростью открытия новых антибиотиков [17,18] возродили интерес к фагам как к антибактериальным препаратам [19‒21].

В отличие от большинства антибиотиков, фаги часто обладают высокой специфичностью к определенным видам или штаммам бактерий, и поэтому ожидается, что они будут оказывать меньше побочного действия на комменсальную микрофлору, чем антибиотики [22]. Дополнительными преимуществами фагов являются их самовоспроизводимость и доступность простого, быстрого и дешевого процесса их производства [22]. Фаги использовались не только для лечения и предотвращения бактериальных инфекций у человека [9‒23,25], но также для контроля заболеваемости растений [26‒29], определения патогенов [30‒33] и оценки безопасности пищи [34‒37]. 

Независимо от их антимикробного потенциала, существует ряд проблем относительно использования фагов в клинической медицине. Специфичность фагов означает, что они будут избирательно поражать только определенные штаммы бактерий; однако тогда один тип фага не сможет инфицировать все штаммы в пределах вида, потому для элиминации широкого спектра бактерий потребуются “коктейли” из нескольких типов фагов. Ввиду высокого разнообразия структуры, жизненного цикла и способа организации генома фагов серьезной проблемой представляется получение одобрения регуляторных органов для применения таких фаговых коктейлей [22,38]. Как и некоторые антибиотики, фаги могут вызывать быстрый массивный лизис бактерий и высвобождение их компонентов (например, липополисахаридов — ЛПС), что может привести к нежелательному иммунному ответу [39,40]. Бактерии часто образуют сообщества в виде биопленки, где они окружены внеклеточным полимерным матриксом (ВПМ), препятствующим проникновению фагов [41]. Кроме того, по мере эволюции бактерии могут также выработать механизмы резистентности к инфицированию фагами [38,42,43], однако преодолеть эти ограничения возможно благодаря генетически модифицированным фагам [44]. Постоянный рост баз данных полного секвенирования геномов фагов [45,46], исследования структуры компонентов фагов [47‒51], а также исследования взаимодействия фагов и бактерий [52‒54] способствуют созданию специфических фагов и их компонентов. В данном обзоре рассматриваются достижения последних десяти лет в области генетической инженерии и применения фагов. Например, авторы обсуждают использование фагов для контроля и определения патогенов, а также их более широкое применение в других областях исследований, включая целенаправленную доставку лекарств и создание материалов.

Техники для создания синтетических фагов
Гомологичная рекомбинация

Гомологичная рекомбинация в клетке бактерии-хозяина является наиболее хорошо отработанным и изученным методом создания геномов фагов. Гомологичная рекомбинация может происходить между двумя гомологичными последовательностями ДНК длиной не менее 23 п.н. (пар нуклеотидов) [55,56]. Кроме того, гомологичная рекомбинация является естественным процессом. Она позволяет клеткам частично обменивать попавшую внутрь гетерологичную ДНК с их собственной ДНК при наличии гомологичных участков [57,58]. Этот механизм также может быть использован для внедрения чужеродных генов в геном фагов (Рис. 1). Создание генных вставок, замен или делеций путем гомологичной рекомбинации с фаговой ДНК следует принципам, похожим на те, которые применяются для бактериальных нуклеиновых кислот. Как и во всех методах генной инженерии фагов, описанных ниже, важным моментом для успешного дизайна последовательностей, с помощью которых будут модифицироваться фаги, является секвенирование генома. Ген, который будет введен в геном фага, должен быть фланкирован с двух сторон двумя гомологичными регионами, и сперва этот ген клонируется в репликативных плазмидах. Гомологичные регионы определяют, в какую область генома фага будет внедрен данный ген [59]. Затем бактерия, несущая донорскую плазмиду, инфицируется фагом, который планируется модифицировать. Между геномом фага и плазмиды происходит гомологичная рекомбинация, позволяя гетерологичному гену попасть в геном фага, который затем упаковывается в фаговые частицы [59,60].

Однако лишь небольшая часть получившихся фагов будут рекомбинантными. Обычно частота рекомбинаций составляет от 10-10 до 10-4 [59‒61], хотя, в зависимости от фага и выбранного для манипуляций гена, она может быть и выше. Без эффективных методов скрининга фагов поиск желаемого клона среди получившейся популяции фагов будет как минимум трудоемким. Поэтому для облегчения идентификации мутантных фагов вместе с исследуемым геном обычно вставляют “ген-индикатор” — ген люциферазы или ген флуоресцентного белка [59, 62‒65].

Так как частота рекомбинации при использовании этой методики низкая, очень маловероятно, что при работе сразу с несколькими локусами будут получены клоны, несущие желаемые мутации. Поэтому при необходимости внести несколько мутаций процедуры редактирования генома фага обычно происходят независимо и последовательно, что в итоге превращается в очень долгий процесс.